1、PCR

PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，體系中加入dNTP、Mg2+以及延伸因子、擴(kuò)增增強(qiáng)因子，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA。

2、熱啟動PCR

常規(guī)PCR的擴(kuò)增開始時(shí)間并不是放進(jìn)PCR儀，運(yùn)轉(zhuǎn)程序才開始擴(kuò)增。當(dāng)體系配置完成的時(shí)候，擴(kuò)增就開始了，這可能會引起非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)，熱啟動PCR可以解決這一問題。什么是熱啟動PCR？當(dāng)反應(yīng)體系配制好后，在反應(yīng)初始加熱階段或“熱啟動”階段，酶修飾物在高溫下（通常90 ℃）被釋放，使得DNA聚合酶被激活。具體激活時(shí)間和溫度取決于DNA聚合酶以及熱啟動修飾物的性質(zhì)。該方法主要利用抗體、親合配體、或化學(xué)修飾物等修飾物，來抑制的DNA聚合酶的活性。由于DNA聚合酶在常溫下的活性被抑制，熱啟動技術(shù)為在常溫下配制多個(gè)PCR反應(yīng)體系提供了的便利，且無需犧牲PCR反應(yīng)的特異性。

3、逆轉(zhuǎn)錄PCR

逆轉(zhuǎn)錄PCR，是從mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以此為模板進(jìn)行擴(kuò)增的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。實(shí)驗(yàn)流程是先提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以O(shè)ligo（dT）為引物，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。

注：oligo(dT)是由數(shù)量少于20的脫氧胸苷酸連接而成的核苷酸鏈，它可以特異性地結(jié)合到mRNA的poly(A)尾端(多A尾)，從而使逆轉(zhuǎn)錄酶只能逆轉(zhuǎn)錄含有poly(A)尾的mRNA。
4、熒光定量PCR

熒光定量PCR（RT-qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對模板進(jìn)行定量分析的方法。常用的qPCR方法有熒光染料法（SYBR Green I）和探針法（TaqMan）。染料法（常用SYBR Green Ⅰ）：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，沒有摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。探針法（常用TaqMan探針）：探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。

5、數(shù)字PCR

數(shù)字PCR（dPCR）是一種核酸分子定量技術(shù)。當(dāng)前核酸分子的定量有三種方法，光度法基于核酸分子的吸光度來定量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time PCR）基于Ct值，Ct值就是指可以檢測到熒光值對應(yīng)的循環(huán)數(shù)；數(shù)字PCR是新的定量技術(shù)，基于單分子PCR方法來進(jìn)行計(jì)數(shù)的核酸定量，是一種定量的方法。主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會給出熒光信號，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。除了基因表達(dá)和拷貝數(shù)檢測，數(shù)字PCR也適用于諸如低頻等位基因的辨別、病毒滴定和二代測序文庫的定量。

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